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目录1

1 DNA迁移率变动分析1

1.1 概述1

1.2 DNA结合蛋白的检测2

1.2.1 DNA迁移率变动分析的应用2

1.2.2 DNA探针的选择5

1.2.3 用于阻滞分析的标记寡聚核苷酸探针的制备6

1.2.4 限制性片段探针的标记7

1.2.5 蛋白提取物的制备9

1.2.6 结合反应11

1.2.7 少量提取物的制备13

1.3 用于结合分析的蛋白质的其他来源13

1.3.1 在细菌中表达DNA结合蛋白14

1.3.2 用哺乳动物细胞表达蛋白15

1.3.3 体外转录和翻译——体外表达15

1.3.4 用杆状病毒系统表达转录因子16

1.3.5 转录因子蛋白的纯化16

1.4 DNA结合特性的分析16

1.5 DNA结合蛋白的特性18

1.5.1 抗体的添加18

1.5.2 潜在配基的添加19

1.5.3 酶解剪除后的带变动分析20

1.6 蛋白-蛋白相互作用的分析21

1.7 结论22

2 DNA-蛋白质复合体体外和体内足迹分析24

2.1 概述24

2.2 体外足迹分析26

2.2.1 以结合位点碱基级分辨率对32P末端标记的片段进行分析26

2.2.2 在闭合环状质粒上的结合分析40

2.3 体内足迹分析44

2.3.1 体内DNA修饰49

2.3.3 用于LMPCR的接头52

2.3.2 基因特异性巢式引物52

2.3.4 LMPCR核苷酸分辨率的可视化53

3 体外转录和转录因子的特征61

3.1 概述61

3.2 体外转录分析61

3.3 天然转录因子相对分子质量的测定66

3.3.1 用凝胶过滤色谱测定相对分子质量67

3.3.2 用甘油梯度离心测定相对分子质量70

3.3.3 用非变性梯度凝胶电泳测定天然转录因子的分子质量72

3.4 变性转录因子分子质量的测定74

3.4.2 与溴脱氧尿苷置换的DNA进行UV交联75

3.4.1 转录因子与DNA的紫外交联75

3.4.3 转录因子与未置换探针的紫外交联78

3.4.4 从SDS-聚丙烯酰胺凝胶复性转录因子80

3.5 DNA结合型转录因子的单体和二聚体的结构分析81

3.5.1 通过DNA凝胶阻滞分析解析转录因子82

3.5.2 通过化学交联分析转录因子亚基83

3.5.3 与相邻应答元件结合的二聚体之间的协同结合分析84

3.6 非DNA结合转录因子的鉴定及其初步特征85

3.6.1 分析DNA结合和非DNA结合转录因子之间的直接结合86

3.6.2 “超级阻滞”凝胶阻滞分析87

3.6.3 在非DNA结合转录因子存在和缺乏时转录因子-DNA复合体的解离分析88

3.6.4 用免疫共沉淀分析转录因子间的直接相互作用89

4 DNA结合转录因子的纯化及克隆93

4.1 概述93

4.2 缓冲液与溶液94

4.3 核提取物的制备96

4.4 DNA-纤维素层析99

4.5 DNA亲和层析100

4.6 反相层析107

4.7 多肽的制备与分离108

4.8 用于分离cDNA的寡核苷酸的设计113

5.1 概述119

5 用cDNA表达文库克隆转录因子119

5.2 噬菌体表达文库的构建120

5.2.1 文库的选择120

5.2.2 文库的平板筛选120

5.2.3 噬菌斑的纯化122

5.3 筛选方法122

5.3.1 简介122

5.3.2 以DNA结合位点为探针的筛选法123

5.3.3 免疫筛选129

5.3.4 文库筛选的其他方法及其相对优点132

5.4 因子的鉴定133

6.2 克隆转录因子的方法138

6.2.1 低严紧杂交138

6 由序列相似性克隆转录因子138

6.1 简介138

6.2.2 聚合酶链式反应法141

6.2.3 In silico法鉴定新的转录因子151

6.3 由同源性克隆转录因子的一些例子153

7 采用结合位点克隆技术鉴定转录因子的靶基因155

7.1 概述155

7.2 利用核DNA结合位点（GBS）的克隆方法155

7.2.1 转录因子蛋白的制备156

7.2.2 DNA的来源159

7.2.4 GBS克隆程序160

7.2.3 筛选程序160

7.2.5 对CpG岛的GBS克隆法163

7.3 利用由GBS克隆法获得的DNA片段进行靶基因分子克隆164

7.3.1 同源序列印迹分析164

7.3.2 RNA印迹分析164

7.3.3 测序与DNA数据检索165

7.3.4 核基因片段的结合活性166

7.3.5 核基因片段的增强子活性167

7.3.6 用GBS克隆所得DNA片段克隆靶基因167

7.4 结论168

8.1 概述170

8 克隆的转录因子的分析170

8.2 用缺失和点突变对结构域进行作图与分析171

8.2.1 用PCR制作缺失突变体172

8.2.2 点突变173

8.3 表达系统175

8.3.1 利用体外翻译系统和过量表达系统分析转录因子功能175

8.3.2 在细菌中表达177

8.3.3 在哺乳动物细胞中表达180

8.3.4 在哺乳动物细胞中过量表达181

8.3.5 在酵母和昆虫细胞中过量表达182

8.3.6 表达体系的比较183

8.4 克隆的因子的特性分析184

8.4.1 哺乳动物细胞的瞬时转染184

8.4.2 报道基因和对照质粒184

8.4.3 转染方法186

8.4.4 转染细胞中报道基因的活性分析187

8.4.5 用嵌合蛋白鉴定反式激活结构域189

8.5 蛋白质与DNA之间相互作用的分析189

8.5.1 利用凝胶阻滞实验分析DNA结合活性189

8.6 体外蛋白质之间相互作用的分析193

8.6.1 用GST钓鱼分析法测定蛋白质之间的相互作用193

8.6.2 用免疫沉淀法分析蛋白质之间的相互作用194

8.6.3 用凝胶阻滞实验分析蛋白质之间的相互作用195

8.6.4 用ABCD法分析蛋白质与蛋白质间的相互作用197

8.6.5 用双杂交法分析细胞内蛋白质与蛋白质间的相互作用199

8.7 小结199

9 利用鼠脑细胞核提取物体外转录分析神经元启动子201

9.1 概述201

9.2 背景201

9.3 应用202

9.3.1 与转染和转基因鼠研究的比较202

9.3.2 研究染色质结构对转录的影响202

9.4.2 鼠脑细胞核提纯203

9.4.1 简介203

9.4 细胞核提取物的制备203

9.4.3 细胞核蛋白质的提取205

9.5 体外转录209

9.5.1 体外转录反应概述209

9.5.2 体外转录的典型结果210

9.5.3 体外转录的注意事项211

9.5.4 启动子模板212

9.6 结束语212

10.2 利用染色质模板的实验方法214

10.2.1 染色质结构简介214

10.1 概述214

10 用于转录研究的染色质模板的制备214

10.2.2 在染色质模板上转录的起始和延伸215

10.2.3 单核小体与多核小体模板215

10.3 染色质模板的制备216

10.3.1 技术考虑216

10.3.2 爪蟾（Xenopus）细胞核提取物217

10.3.3 果蝇胚胎细胞核提取物218

10.3.4 微小染色体制备（minichromosome preparation）218

10.3.5 单核小体制备219

10.4 组蛋白的制备220

10.4.1 羟磷灰石（hydroxyapatite）纯化的原理220

10.5.1 用于重建的DNA片段所应注意的问题227

10.5 通过盐-尿素透析重建单核小体227

10.5.2 重建反应中需要的DNA量230

10.5.3 计算在重建反应中组蛋白的量231

10.5.4 核小体重建的纯化233

10.5.5 重建核小体的鉴定235

10.6 结合核小体模板的转录因子239

11 转录因子修饰分析243

11.1 概述243

11.2 磷酸化243

11.2.1 凝胶电泳245

11.2.2 体外去磷酸化247

11.2.3 放射性标记251

11.2.4 磷酸化位点作图253

11.2.5 体外磷酸化262

11.2.6 磷酸化位点特异性抗体的制备和使用264

11.2.7 功能分析264

11.2.8 分析磷酸化蛋白的其他方法265

11.3 其他转录后的修饰266

11.3.1 O-连糖基化266

11.3.2 其他的修饰271

11.4 结论271

附录 常用缩略词275